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Influence du sulfure sur la croissance diazotrophique du méthanogène Methanococcus maripaludis et ses implications sur l'origine de la nitrogénase

Jul 18, 2023Jul 18, 2023

Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 799 (2023) Citer cet article

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Les méthanogènes habitent des environnements euxiniques (riches en sulfures) ou ferrugineux (riches en fer) qui favorisent la précipitation des métaux de transition sous forme de sulfures métalliques, comme la pyrite, réduisant ainsi la disponibilité des métaux ou du soufre. De tels environnements ont été courants tout au long de l'histoire de la Terre, soulevant la question de savoir comment les anaérobies ont obtenu (utilisé) ces éléments pour la synthèse de cofacteurs enzymatiques. Ici, nous montrons qu’un méthanogène peut synthétiser des métallocofacteurs de molybdène nitrogénase à partir de la pyrite comme source de fer et de soufre, permettant ainsi la fixation de l’azote. Les cellules fixatrices d'azote cultivées sur pyrite se développent plus rapidement et nécessitent 25 fois moins de molybdène que les cellules cultivées dans des conditions euxiniques. Les rendements de croissance sont 3 à 8 fois plus élevés dans les cultures cultivées dans des conditions ferrugineuses que dans des conditions euxiniques. Les données physiologiques, transcriptomiques et géochimiques indiquent que ces observations sont dues à une limitation des métaux favorisés par les sulfures, en particulier le molybdène. Ces résultats suggèrent que la nitrogénase de molybdène pourrait provenir d'un environnement ferrugineux titrant le sulfure pour former de la pyrite, facilitant ainsi la disponibilité de suffisamment de fer, de soufre et de molybdène pour la biosynthèse des cofacteurs.

L'azote (N) est essentiel à la synthèse des acides nucléiques et aminés et d'autres biomolécules clés dans toutes les formes de vie. Le plus grand réservoir de N sur Terre est le diazote (N2) gazeux présent dans l’atmosphère ; cependant, il n'est pas biodisponible et doit être fixé au nitrate (NO3-) ou à l'ammoniac (NH3) avant son assimilation. Ainsi, la disponibilité de N fixe limite souvent la productivité des écosystèmes1. Sur la Terre primitive, on pense que l’azote fixe a été fourni par des processus abiotiques tels que l’oxydation par la foudre du N2 atmosphérique ou la réduction minérale du N22,3. Cependant, l’azote fixe provenant de ces sources aurait été minime et limité, et on pense que, ensemble, ces caractéristiques ont limité la productivité de l’écosystème pendant cette période1. Aujourd’hui, environ 50 % de tout l’azote fixe est généré par le processus biologique de fixation du N21,4, dans lequel le N2 est réduit en NH3 par l’enzyme nitrogénase (diazotrophie), le reste de l’azote fixe étant en grande partie généré par le procédé industriel Haber-Bosch.

Trois formes différentes de nitrogénase ont été décrites à ce jour et celles-ci se différencient par les (hétéro)métaux constituant le site actif de chaque complexe enzymatique5. Cela comprend les formes de nitrogénase composées uniquement de molybdène (Mo), de vanadium (V) et de fer (Fe)6,7. La Mo-nitrogenase (Nif) est taxonomiquement la forme de nitrogénase la plus largement distribuée et la plus ancienne8,9 et, au minimum, se compose des protéines structurelles NifHDK et des protéines maturase, NifB(E)N10. Le métallocluster du site actif de Nif comprend un noyau de six atomes de fer (Fe) et neuf atomes de soufre (S), Fe coordonnant symétriquement un atome de carbone central ; le métallocluster est coiffé d'atomes de Fe et de Mo [7Fe-Mo-9S] (appelé cofacteur FeMo10,11). En plus du ou des cofacteur(s) FeMo, Nif nécessite le groupe P complexe composé de huit atomes de Fe et de sept atomes de S [8Fe-7S]12. Un cofacteur FeMo est logé dans chaque protéine structurale NifD, tandis que le cluster P se trouve à l'interface de chaque NifD et NifK, formant finalement l'hétérotétramère, NifD2K213. La dinitrogénase réductase, NifH, module le transfert d'électrons dépendant de l'ATP vers NifD2K2 et héberge un cluster [4Fe-4S] supplémentaire pour chacune des deux sous-unités NifH . Ainsi, les cellules effectuant la fixation de N2 via Nif ont une forte demande en Fe, S, Mo, ATP et équivalents réducteurs.

Les analyses phylogénétiques d'une concaténation de protéines NifHDK indiquent que les premières lignées évolutives de Nif se trouvent dans les méthanogènes hydrogénotrophes6,7,8,9,16,17. Ces observations sont corroborées par d'autres données indiquant que NifHDK a évolué à partir d'une série de duplications de gènes codant pour un ancêtre de CfbCD8, protéines nécessaires à la synthèse du cofacteur F43018,19. Le fait que F430 (et les gènes codant pour CfbCD) se trouvent exclusivement chez les méthanogènes archéens (et les alcanotrophes archéens)20 est une preuve supplémentaire indiquant une origine de Nif parmi les ancêtres de ces archées. Ces données ont été utilisées pour suggérer une origine du Nif parmi un ancêtre des méthanogènes anaérobies au milieu du Paléoprotérozoïque il y a environ 1,8 à 2,1 milliards d'années (Ga)6,9,17, bien que les données isotopiques de la matière organique préservées dans les schistes datent de > 3 Ga suggèrent une origine encore plus ancienne21,22. Quelle que soit la date réelle de son origine, la nitrogénase est interprétée comme une ancienne enzyme originaire d’un environnement anoxique au début de la Terre. Une origine anoxique de cette enzyme est cohérente avec la sensibilité à l'oxygène des amas métalliques nécessaires à la fonction Nif . Le Nif s'est ensuite diversifié parmi les anaérobies et ce n'est que tard dans son histoire évolutive qu'il a été acquis via un transfert horizontal de gènes entre organismes capables d'intégrer l'oxygène (O2) dans leur métabolisme énergétique ou capables de produire de l'O2 dans le cas des cyanobactéries. Une productivité biologique accrue associée à la prolifération des cyanobactéries et à la production d'O2 aurait accru la demande de réservoirs abiotiques existants de N24 fixe, ce qui aurait pu constituer une pression sélective pour développer un mécanisme biologique permettant de réduire le N2 atmosphérique et de soulager la limitation de l'azote7,25.

2.4 Ga)26,27. This is due to the circulation of hydrothermal fluids through iron-rich mid-ocean basalts, which led to input of a greater amount of Fe(II) into anoxic ocean basin waters than sulfide (HS-)28. In the absence of oxygen, the excess Fe(II) would have been stable, and free Fe(II) concentrations are estimated to have ranged from 0.05 to 0.5 mM29. However, the proliferation of Cyanobacteria and the production of O2 during the late Archean drove the oxidative weathering of continental sulfide minerals that increased the flux of sulfate into oceans. When combined with increased productivity near ocean margins30,31, this would have stimulated heterotrophic sulfate reduction and HS- production. In turn, this led to stratified coastal oceans that were oxygenated at the surface and were euxinic (anoxic and HS--rich) at depth30,31,32. In contrast, deeper ocean waters and those more distal from continental margins remained ferruginous26, due to lower productivity in the overlying water column, decreased availability of sulfate and subsequent heterotrophic sulfate reduction, and hydrothermal input of Fe26,33,34. HS- has a high affinity for Fe(II), resulting in the formation of low-solubility iron-sulfide minerals, including pyrite (FeS2)35,36,37. As such, in euxinic environments, concentrations of HS- exceed that of Fe(II), resulting in the titration and precipitation of Fe(II) as FeS2. Under these conditions, excess HS- is also available to complex with other thiophilic metals (e.g., Mo, Co, Ni), potentially rendering them less bioavailable33,34,38./p>6 mM inhibits N2 fixation in stream sediments72. While this effect was attributed to the toxicity of HS- in cells responsible for N2 fixation, it is plausible that the added HS- influenced the availability of trace metals (e.g., Fe, Mo) required for N2-fixing cells62,73,74,75. A similar effect of HS- on metal availability in N2-fixing MmS2 cultures may explain the lower cell yields and increased expression of Mod genes observed in Fe(II)/HS--grown cells relative to those grown with FeS2. MoO42- is a thiophilic molecule that readily reacts with HS- to form soluble thiomolybdate (MoO4-nSn2-) species that can ultimately be incorporated in sulfide minerals, such as FeS271,76. Such thiolation reactions would be expected to occur under the sulfidic (2 mM) cultivation conditions typically used to culture methanogens77 and that were utilized herein for the Fe(II)/HS--grown cultures. These euxinic cultivation conditions potentially limited the availability of MoO42- such that it did not meet cellular demands./p>400 nM MoO42- was required for growth with an optimum of 4000 nM42. These values are much higher than those required of other N2-fixing organisms. For example, aerobic, N2-fixing cyanobacteria such as Anabaena variabilis81, as well as anaerobic N2-fixing purple sulfur bacteria (PSB) inhabiting the interface of oxic/euxinic waters and that serves as a modern analog of the productive continental margins of Proterozoic oceans82, can be supported by less than 10 nM MoO42-. Interestingly, maximum N2 fixation for the PSB was maximal above the chemocline where HS- was near zero82. Thus, it seems incongruous that methanogens would require 40-fold more MoO42- than these organisms, despite ancestors of methanogens likely being where Nif originated6,9./p>1000 nM MoO42- was provided (Fig. 4d). Strikingly, cells provided with FeS2 grew well under all Mo concentrations tested, including when 0 µM MoO42- was added (Fig. 4c). After this experiment, abiotic reactors containing media and FeS2 (no MoO42- added) were analyzed by ICP-MS and were determined to have background (contaminant) Mo ranging from 10 to 30 nM despite using ACS-grade chemicals and acid-washed glassware. Thus, Fe(II)/HS--grown N2-fixing cells required >500 nM MoO42- to achieve near-optimal growth rates and yields whereas FeS2-grown N2-fixing cells required <30 nM MoO42-./p>10-fold lower than previously reported for this strain42. Further, MmS2 cells can achieve optimal growth rates and yields at MoO42- concentrations that are at levels ~100-fold lower than previously reported42. Despite similar growth rates for the FeS2 conditions at different MoO42- concentrations, there was a positive trend in the cell yield with increasing MoO42- that indicates higher MoO42- concentrations are still beneficial to these cells (Fig. 4d). These findings are consistent with other studies that have shown N2 fixation at low Mo concentrations with cells grown under non-sulfidic conditions81,82. Notably, the low levels (10-30 nM) of MoO42- shown to support N2 fixation herein are similar to the inferred Mo concentrations of Proterozoic oceans83,84,85). Other studies investigating Mo requirements for other methanogen species fixing N2 found 1 to 10 µM MoO42- to be the optimal concentrations86,87. There is one other example of methanogens fixing N2 at low (<10 nM) MoO42- concentrations; Nishizawa et al. showed that isolates of Methanocaldococcus and Methanothermococcus from a hydrothermal vent could fix N2 with as low as 5 nM or 1 µM MoO42-, respectively59. This indicates that different methanogen species within the same hydrothermal environment (at different temperatures) can have very different Mo requirements. Importantly, these past experiments were all performed in the presence of >1 mM HS-, necessitating a re-evaluation of methanogens’, and other anaerobes’, ability to access MoO42- in the absence of high HS-. These data support the hypothesis that N2 fixation via Nif is more efficient in low HS- conditions where Mo is more bioavailable./p> ~3 × 107 cells per mL by centrifugation in 50 mL centrifuge tubes (Globe Scientific, Mahwah, NJ) for 30 min at 4696 x g at 4 °C. The supernatant was removed using a line and needle under low-vacuum and the cells were resuspended in 8 mL of basal medium and transferred to a 15 mL centrifuge tube (Globe Scientific)./p>

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